Entomology today. Una mirada al interior de cómo se descubrió la verdadera dieta de Varroa Mite

lunes 25 de febrero de 2019

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‎Mohammad Alrababah‎ en Apiculture world

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Una mirada al interior de cómo se descubrió la verdadera dieta de Varroa Mite

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En esta imagen coloreada de una abeja, tomada a través de un microscopio electrónico de barrido a baja temperatura, se puede ver un ácaro Varroa (flecha) metido entre los segmentos abdominales de la abeja. (Crédito de la foto: USDA-ARS, Unidad de microscopía electrónica y confocal, Beltsville, Maryland)

Por Samuel Ramsey, Ph.D., Ron Ochoa, Ph.D., Joe Mowery, Chris Pooley, Connor Gulbronson, Ph.D., y Gary Bauchan, Ph.D.

Varroa destructor , un ácaro que se alimenta de las abejas melíferas, es el mejor impulsor del declive mundial de la salud de las abejas. Durante años, a los científicos y a los apicultores se les dijo que el ácaro Varroa se alimenta de la hemolinfa (la sangre de la abeja) basándose en investigaciones científicas realizadas hace mucho tiempo. Sin embargo, para nuestro equipo de investigación dirigido por Samuel Ramsey, Ph.D., esto no tenía sentido, ya que el sistema digestivo y las piezas bucales de los ácaros simplemente no parecían estar estructurados adecuadamente para la alimentación de sangre. Sus parientes evolutivos más cercanos tampoco eran alimentadores de sangre. Como lo señaló el experto en crianza de insectos Allen Cohen, Ph.D., incluso su excremento era incorrecto para ellos como alimentadores de sangre.

Entonces, ¿cómo y de qué se alimentan exactamente estos ácaros? Nuestro descubrimiento está documentado en un artículo publicado a fines de enero en Actas de la Academia Nacional de Ciencias .

Ramsey, entonces un Ph.D. el estudiante de Dennis vanEngelsdorp, Ph.D., de la Universidad de Maryland, College Park, comenzó su investigación con una pregunta simple: ¿Se alimentan los ácaros Varroa en un solo lugar? Si los ácaros pueden alimentarse en cualquier lugar con las abejas ( Apis mellifera ) como lo puede hacer una garrapata en una persona, entonces es probable que se estén alimentando de un tejido disponible en todo el cuerpo de la abeja (como la hemolinfa). Sin embargo, si los ácaros se alimentan solo en un punto, tal vez se estén alimentando de un tejido específico para esa ubicación. De las 104 observaciones, los ácaros de las abejas adultas solo se encontraron debajo de las placas abdominales de su huésped. Ramsey consideró que este podría ser su sitio de alimentación, pero sabía que necesitaría ayuda para probarlo.

Esto llevó a Ramsey a la oficina de Ron Ochoa, Ph.D., entomólogo investigador del Laboratorio de Entomología Sistemática y de la Unidad de Microscopía Electrónica y Confocal (ECMU) del Servicio de Investigación Agrícola (USDA-ARS) del Departamento de Agricultura de EE. UU. En Beltsville, Maryland , y el principal experto en ácaros en el USDA-ARS. Además, a la idea de que los ácaros Varroa solo se alimentan de la hemolinfa de las larvas y pupas en desarrollo, los investigadores cuestionaban si los ácaros se alimentaban de abejas adultas. Algunos ya habían llegado a la conclusión de que la alimentación solo se produce en las abejas inmaduras porque nunca se las había visto alimentándose de abejas adultas y porque nos hemos estado refiriendo a la etapa de la vida de los ácaros que se encuentran en las abejas adultas como "foréticas", un término que denota una etapa de no alimentación que Utiliza otro organismo como modo de tránsito.

Gary Bauchan, Ph.D., director de ECMU, Ochoa y Ramsey utilizaron nitrógeno líquido para congelar instantáneamente abejas que tenían ácaros en la región que Ramsey propuso que se estaba alimentando. La posición exacta de los ácaros en las abejas fue tomada en un microscopio electrónico de barrido a baja temperatura (LT-SEM). Las abejas congeladas se retiraron del LT-SEM y los ácaros se separaron cuidadosamente de las abejas. Durante este proceso, Ramsey controló el tiempo de exposición de Ochoa al nitrógeno líquido para evitar quemarse mientras eliminaba los ácaros de las abejas congeladas, un proceso manual que debía realizarse en aproximadamente 10 segundos. Luego, las abejas fueron devueltas al LT-SEM y se tomaron las imágenes del lugar donde se encontraba el ácaro.

El ácaro se presiona con tanta fuerza contra la membrana blanda entre las placas abdominales de la abeja que deja una impresión clara de sus piernas y palmas y una herida en forma de boca en la membrana. Además, en este sitio de alimentación, la ambulacra (almohadillas para los pies) de las patas delanteras permaneció pegada a la membrana de las abejas, lo que nos permite orientarnos rápidamente a la posición del cuerpo del ácaro en relación con la abeja. Repetimos este procedimiento 10 veces para demostrar que era donde los ácaros se alimentaban.

En esta imagen coloreada tomada a través de un microscopio electrónico de barrido a baja temperatura, es visible la impresión de un ácaro Varroa en la pared abdominal de una abeja. Las flechas blancas identifican las almohadillas para los pies del ácaro que permanecieron adheridas después de la eliminación del ácaro. La flecha negra identifica el sitio de alimentación del ácaro. (Crédito de la foto: USDA-ARS, Unidad de microscopía electrónica y confocal, Beltsville, Maryland)

Una sección longitudinal a través de la fractura por congelación directamente a través de la abeja y su ácaro adjunto confirmó en detalle que las piezas bucales relativamente cortas de Varroa (200 micrones) descansan justo dentro de la abeja, que es un área rodeada por tejido graso y hemolinfa, dejando nosotros con la conclusión de que los ácaros se alimentan de abejas adultas. También nos sugirió que los ácaros podrían estar alimentándose de un órgano denso en nutrientes llamado cuerpo graso, que es análogo al hígado de los mamíferos.

Esta imagen longitudinal de fractura por congelación, tomada a través de un microscopio electrónico de barrido a baja temperatura, revela una sección transversal de un ácaro Varroa (rojo) entre los segmentos abdominales de una abeja. (Crédito de la foto: USDA-ARS, Unidad de microscopía electrónica y confocal, Beltsville, Maryland)

Para determinar si el cuerpo gordo estaba siendo consumido, el equipo tuvo que verlo más de cerca. Joe Mowery, científico de apoyo en el ECMU, y Ramsey recolectaron y prepararon muestras colocando el ácaro de alimentación en la abeja con pegamento de cianoacrilato antes del procesamiento. Luego, se obtuvieron y estudiaron secciones ultra delgadas utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Se descubrió una clara evidencia de que los ácaros se descomponían y eliminaban el tejido corporal graso mediante la digestión extraoral (y creaban un punto de entrada para las colonias de microbios).

Esta imagen de microscopía de campo brillante de sección semifina muestra un ácaro Varroa entre los segmentos abdominales de una abeja, así como el sitio de la herida y los cuerpos grasos. (Crédito de la foto: USDA-ARS, Unidad de microscopía electrónica y confocal, Beltsville, Maryland)

Mientras que la observación y la microscopía electrónica habían producido evidencia clara de la alimentación corporal con grasa, la investigación se dirigió a Connor Gulbronson, Ph.D., del Instituto de Ridge Ridge para la Ciencia y la Educación, becario postdoctoral con la Unidad de Investigación de Plantas Florales y de Viveros del USDA-ARS (ubicada en dentro de la ECMU), y su experiencia en microscopía de fluorescencia y confocal para determinar si el cuerpo gordo es el tejido primario consumido. Ramsey generó una dieta que contiene dos biostain fluorescentes para etiquetar la hemolinfa de la abeja (amarilla) y el cuerpo gordo (roja). Gulbronson desarrolló protocolos para blanquear los exoesqueletos de los ácaros, lo que permite obtener imágenes de las estructuras internas.

Las abejas con sus brillantes entrañas luego fueron expuestas a la hambrienta Varroa. Los resultados fueron impresionantes. Gulbronson y Ramsey fotografiaron ácaros con sistemas digestivos fluorescentes de color rojo brillante con muy poca fluorescencia perceptible en el rango amarillo. Para asegurarse de que las biostras estuvieran teñidas en los tejidos correctos, cada abeja se diseccionó y se tomó una imagen para compararla con la fluorescencia dentro de los ácaros. Este trabajo proporcionó la evidencia más clara hasta el momento de que los ácaros consumían principalmente tejido corporal graso.

En esta imagen de microscopía fluorescente de un ácaro Varroa , el cuerpo graso consumido por el ácaro se marca mediante una tinción fluorescente roja en el interior del intestino de un ácaro disecado. (USDA-ARS, Unidad de microscopía electrónica y confocal, Beltsville, Maryland)

Todas las facetas de este proyecto se alinearon apuntando a una conclusión, pero Ramsey quería estar seguro de que este tejido claramente consumido en las abejas adultas era el mismo tejido consumido en las larvas y pupas en desarrollo. Para determinar esta relación, Ramsey desarrolló un novedoso sistema de crianza in vitro , que imitaba las células de cría en las que se desarrollan las abejas de miel inmaduras, y construía pupas de señuelo para imitar al huésped del ácaro. Esto permitió que Ramsey y los técnicos de laboratorio Judith Joklik y David Lim emprendieran la tediosa tarea de alimentar a los ácaros con dietas compuestas por los diferentes tejidos de interés.

Los ácaros que se alimentaron exclusivamente con hemolinfa de abeja de miel se murieron de hambre rápidamente y produjeron muy pocos huevos, no muy diferentes del grupo de control que no recibió ningún alimento. Sin embargo, los ácaros alimentados exclusivamente con cuerpos grasos sobrevivieron sustancialmente mejor que todos los otros tratamientos y produjeron muchos más huevos. Esta fue la primera vez que alguien pudo criar ácaros Varroa in vitro sin alimentarse directamente de las abejas. Estos descubrimientos proporcionaron al estudio la última línea de evidencia necesaria para decir de manera concluyente que Varroa no alimenta la sangre sino que se alimenta de grasa.

Investigadores que estudian el comportamiento de alimentación del ácaro Varroa destructor idearon un sistema de crianza in vitro que imitaba las células de cría de las abejas melíferas ( Apis mellifera ) con pupas de señuelo en el interior para alimentar a los ácaros de la hemolinfa y la grasa del tejido corporal. (Foto publicada originalmente en Ramsey et al 2019, Actas de la Academia Nacional de Ciencias . Publicada con permiso).

En conjunto, este enfoque multidisciplinario de ensayos de alimentación, análisis observacional y varias tecnologías de microscopía generó un cambio de paradigma en nuestra comprensión de cómo, dónde y qué obtiene el ácaro Varroa cuando parasita a las abejas hospedadoras. Esta investigación proporciona un camino para el desarrollo de estrategias para controlar esta gran plaga de las abejas en todo el mundo.

Miembros del equipo de investigación Varroa de la Unidad de Microscopía Electrónica y Confocal (ECMU) del Servicio de Investigación Agrícola del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA-ARS). De pie (de izquierda a derecha): Chris Pooley, especialista en informática; Gary Bauchan, director de ECMU; Joe Mowery, especialista en microscopía electrónica de transmisión; y Connor Gulbronson, Ph.D., becario postdoctoral del Instituto de Ciencia y Educación de Oak Ridge. Sentados (de izquierda a derecha): Ron Ochoa, Ph.D., entomólogo y acarólogo, Laboratorio de Entomología Sistemática USDA-ARS, y Samuel Ramsey, Ph.D., entonces estudiante de doctorado en la Universidad de Maryland. (Crédito de la foto: USDA-ARS, Unidad de microscopía electrónica y confocal, Beltsville, Maryland.

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procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias

Samuel Ramsey, Ph.D. , es un investigador postdoctoral en el Departamento de Entomología de la Universidad de Maryland, en College Park, Maryland. Correo electrónico: insectious@gmail.com . Ron Ochoa, Ph.D. , es un entomólogo de investigación en el Laboratorio de Entomología Sistemática del Servicio de Investigación Agrícola del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA-ARS), en Beltsville, Maryland. Correo electrónico: ron.ochoa@ars.usda.gov . Joe Mowery es un científico de apoyo en la Unidad de Microscopía Electrónica y Confocal del USDA-ARS (ECMU) en Beltsville, Maryland. Correo electrónico: joseph.mowery@ars.usda.gov . Chris Pooley es un especialista de TI en el USDA-ARS ECMU. Correo electrónico: chris.pooley@ars.usda.gov .Connor Gulbronson, Ph.D. , es becario postdoctoral del Instituto de Ciencia y Educación de Oak Ridge en la Unidad de Investigación de Plantas Florales y de Viveros del USDA-ARS en Beltsville, Maryland. Correo electrónico: connor.gulbronson@ars.usda.gov . Gary Bauchan, Ph.D. , es director del USDA-ARS ECMU. Correo electrónico: gary.bauchan@ars.usda.gov .