Argentina. Efecto de la suplementación proteica Apipromotor®

lunes 12 de diciembre de 2011
Enviado a lapisada por Magdalena Fey "Apifey"
www.apifey.com.ar

Efecto de la suplementación proteica Apipromotor® a distintos pH sobre los niveles de expresión de vitelogenina y proteínas totales en cuerpos grasos abdominales de Apis mellifera

Sarlo, E.¹; Quintana, S.³; Medici, S.^1,2,3,; Eguaras, M.^1,2 Fey, M.⁴

¹ Laboratorio de Artrópodos, Universidad Nacional de Mar del Plata. ² CONICET ³ Fares Taie Instituto de Análisis. ⁴ Apifey SA

Introducción

Uno de los mecanismos que median el control de la organización social del trabajo de las abejas es la variación en la expresión del gen de la vitelogenina. El nivel de expresión  o de otra manera, la cantidad de mensajero genético (ARNm) que la abeja obrera fabrica para que se sintetice Vitelogenina (Vg) en la etapa temprana de la vida, determinará su comportamiento posterior. La Vg  resulta ser la proteína más abundante en la hemolinfa de A. mellifera L. y es sintetizada por las obreras los primeros 7 a 10 días de emergidas.

La expresión de vitelogenina en los primeros cuatro días de vida de la abeja determina la edad de inicio y destino del pecoreo (néctar o polen). La longevidad de las abejas, la cría, producción de miel y la resistencia a las enfermedades son parámetros que se reducen cuando la disponibilidad de proteínas es inadecuada. La producción de Vg es fuertemente dependiente de la disponibilidad de alimento proteico.

El manejo productivo de las colonias en Argentina sostiene un inicio temprano del desarrollo de la colonia con respecto a la floración. Sea cual sea el objetivo productivo, se expone a las colonias a una situación de dependencia de reservas nutricionales (pan de abeja o polen ya ensilado) que no siempre están presentes, por lo que resulta imprescindible suministrar alguna dieta de constatado valor nutricional si se desea mantener el flujo de proteínas dentro de las colonias y evitar los efectos adversos que produce su carencia.

El objetivo del presente trabajo fue comparar los niveles de expresión de Vg y proteínas totales presentes en los cuerpos grasos abdominales de abejas con disponibilidad y carencia de reservas polínicas versus el efecto del suministro a distintos pH del suplemento proteico Apipromotor®.

Materiales y Métodos:

Obtención del material vivo

Las 300 abejas implicadas en la presente investigación fueron obtenidas a partir de un panal de cría operculada proveniente de una colonia de Apis mellifera.

Seleccionados los individuos por sus condiciones morfológicas normales, se procedió en forma aleatoria a distribuirlos en contenedores con el objeto de conformar seis grupos. Las abejas de cada grupo fueron marcadas con una gota de pintura del color correspondiente en el tórax y sometidas a cada tratamiento experimental según se presenta en la Tabla 1 y Fig. 1.

Las abejas correspondientes a cada grupo fueron divididas a la mitad (n=25) y alojadas en 2 unidades experimentales de campo (uec) de tamaño reducido (n=12) (Fig. 2)

Las  uec receptoras de las abejas de los distintos grupos de tratamiento contaban con no menos de 600 gramos de abeja, una abeja reina joven en postura y al menos 3 panales con cría en distintos estadios de desarrollo.

Con el objetivo de evitar el acopio de polen en las uec destinadas a los grupos 3 a 6, fueron instalados con una anticipación de 10 días placas perforadas de 0,55 mm de diámetro en la piquera de forma tal que al ingresar las abejas, las corbículas pierdan el polen recolectado.

Cuatro días antes de la introducción de las abejas marcadas, se reemplazaron en los grupos 3 a 6 los panales con acopio de miel y polen por vacíos, mientras que en los uec correspondientes a los grupos 1 y 2 se reemplazaron por uno vacio y uno con polen ensilado. Conjuntamente se administraron los tratamientos en alimentador interno a razón de 200 ml cada 2 días hasta concluir con el experimento (Fig. 3),

Las soluciones correspondientes a cada tratamiento se realizaron en base a jarabe de caña de azúcar al 66% en agua. A los grupos 5 y 6 se le agregó un volumen del complemento Apipromotor® a razón de 7 ml/ l según la recomendación de marbete.

Salvo para el caso del grupo 5 ya que el pH resultante de la solución de   jarabe mas Apipromotor® es de 7,48, se procedió a acidificar con ácido acético glacial hasta obtener por peachímetro (Hannah digital) los valores del diseño experimental. El valor de pH de 5,86 experimentado en los grupos 2, 4 y 6 fue determinado por solicitud de la empresa y es el valor resultante de agregar un volumen  de 1,5 ml/l  de vinagre de alcohol al jarabe con Apipromotor®.

A los 0, 5, 10 y 21 días de alojados los individuos, se recolectaron al azar 6 abejas vivas de cada grupo de tratamiento (3 por uec).

El trabajo de campo se realizó durante el mes de diciembre de 2010 bajo condiciones ambientales de temperatura media de 21.0ºC, y humedad relativa media de 67.2%.

Estudios de expresión génica

Los abdómenes de cada abeja fueron obtenidos por sección del propodeum. Los segmentos abdominales, junto con los cuerpos grasos adheridos a ellos por defecto, fueron procesados según TriReagent  (Ambion) para obtener el ARN.

La retrotranscripción se realizó mediante la enzima MMLV  (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) a partir de 1 µg del ARN tratado previamente obteniendo así el ADNcopy.

Las reacciones de PCR en tiempo Real se llevaron a cabo utilizando una mezcla preformada y optimizada (EvaGreen, Biodynamics). La detección del producto amplificado por aumento de la fluorescencia en el tiempo se registró en un equipo Rotor Gene.

Con el fin de corroborar la amplificación del producto del peso molecular esperado, los productos de la PCR fueron  corridos en geles de agarosa 2,5% y  teñidos con una solución 0,5 μg/ml de bromuro de etidio en buffer TBE 1X y visualizados en un transiluminador U.V.

Determinación de Proteínas Totales en cuerpos grasos

Las proteínas totales fueron precipitadas del sobrenadante producto de la sedimentación del pellet de RNA y la cuantificación midiendo absorbancia a 595 nm. Se realizó por la técnica de Bradford (Bradford, 1976). Para la curva de calibración se utilizó seroalbúmina bovina como proteína estándar.

Resultados:

Los negativos de retrotranscripción  para  los dos pares de primers de beta actina y Vg no presentaron producto de PCR y se obtuvo en todas las reacciones la amplificación  del producto del peso molecular esperado.

Las eficiencias de amplificación fueron para ambos genes cercanas al 100%

El resultado de de la corrida electroforética en geles de agarosa (Fig. 4) corroboró la presencia de las bandas de los pesos moleculares esperados para cada gen en los productos amplificados.

Los niveles de expresión de Vg (Fig. 5) y proteína total (Fig. 6) correspondientes tiempo 1 no presentaron diferencias significativas entre los Grupos 1, 2, 5 y 6, pero si   resultaron significativamente diferentes a los obtenidos en los  Grupos 3 y 4.

Para el tiempo 2, los niveles de Vg de los grupos 3 y 4 resultaron superiores al resto de los grupos, si bien son estadísticamente diferentes a los grupos 5 y 6, no se encontraron diferencias significativas con los grupos 1 y 2, debido a la alta dispersión registrada por estos grupos en este tiempo de estudio. En contraposición a este resultado, los valores de proteína total para estos grupos fueron significativamente menores que en  los grupos 1, 2, 5 y 6.

En el tiempo 3 los niveles tanto de Vg como de proteína total no presentaron diferencias significativas entre los grupos. 

Discusión:

En base a los resultados obtenidos, se puede constatar que ante la disponibilidad de una fuente proteica,  los niveles de proteínas totales, junto con la expresión génica de Vg  presentan un máximo en la edad correspondiente a la obrera nodriza, para luego decrecer paulatinamente en concordancia con lo propuesto por numerosos autores  (Fluri et al., 1982; Amdam et al., 2006)

Estos resultados se presentaron ante la disponibilidad ad libitum de una fuente proteica, ya sea natural (polen ensilado) o artificial como el compuesto Apipromotor® sin una diferencia significativa entre ambos.

De esto se desprende que el formulado nutricional para abejas Apipromotor® resulta capaz de suplir las demandas proteicas de la abeja nodriza, permitiendo en condiciones de carencia natural que la abeja cumpla con normalidad las distintas etapas de su desarrollo.

Esta conclusión se refuerza al analizar el comportamiento de los niveles de expresión de Vg en los grupos carentes de oferta proteica.

Bajo estas condiciones, los organismos presentaron el nivel de expresión génica máximo a los 10 días de emergidas mientras que en las abejas con disponibilidad de proteínas se presentó a los 5 días. Pese a este incremento tardío de ARNm los títulos de proteínas totales registrados no respondieron de igual forma debido a la carencia de materia prima.

En todos los casos,  a los 21 días se registraron los niveles más bajos en ambos parámetros, demostrando que en presencia o ausencia de proteínas disponibles, la producción de ARNm para la síntesis de Vg disminuye, evidenciando el hecho de que la abeja no fabricará  mas Vg, pese a  no haber logrado las reservas necesarias.

De esta forma podemos establecer que la disponibilidad de proteína natural (pan de abeja) o artificial (Apipromotor®) estimulan tempranamente en la vida de la obrera la producción de ARNm de Vg,  y por ende, los títulos de proteínas totales necesarios para el normal desarrollo y longevidad del organismo.

Conclusiones

El consumo del compuesto Apipromotor® genera en la abeja A. mellifera un efecto en los niveles de expresión génica y consecuente síntesis de vitelogenina similar al pan de abejas, por lo que puede ser utilizado en la industria apícola en reemplazo de polen cuando la oferta es escasa o nula.

El consumo del compuesto Apipromotor® genera en la abeja A. mellifera niveles de proteínas similares a los producidos por el consumo del  pan de abejas, asegurando así la normal atención de la cría, la recolección de polen y longevidad de la abeja.

La expresión génica de vitelogenina ha demostrado ser un parámetro cuantificable válido al momento de comparar la eficacia de las dietas proteicas y es de esperar que también lo sea al evaluar  la calidad nutricional de los distintos pólenes que recolecta la abeja

	Nº de abejas	Polen	pH Jarabe	Concentración Apipromotor® ml/lt de jarabe
Grupo 1	50	+	7,48	0
Grupo 2	50	+	5,86	0
Grupo 3	50	-	7,48	0
Grupo 4	50	-	5,86	0
Grupo 5	50	-	7,48	7
Grupo 6	50	-	5,86	7

Tabla1. Conformación de los grupos y tratamiento administrado.

Figura 1. Un grupo de tratamiento ya identificados por marcado.

Figura 2. Unidades experimentales de campo

Figura 3. Administración de los tratamientos a razón de 200 ml cada 2 días hasta concluir con el experimento.

Figura 4. Electroforesis en gel de Agarosa 2% de los productos de PCR amplificados con los primers de Vitelogenina

Figura 5. Comparación de los distintos niveles de expresión de vitelogenina encontrados para los 6 grupos estudiados. Doble letra indica diferencias significativas para cada tiempo.

Figura 6. Comparación de los valores de proteína total en cuerpos grasos de abejas encontrados para los 6 grupos estudiados. Doble letra indica diferencias significativas para cada tiempo.